活动经验在《生物技术实践》(选修1)中的应用
王美华
生物学高考以能力立意为主导，考查考生对所学相关课程基础知识、基本技能、基本思想、基本活动经验的整体掌握程度和综合运用所学知识发现问题、提出问题、分析、解决实际问题的能力；注重对科学探究能力、科学过程与方法和创新精神的考查。而目前高中阶段生物实验课时偏紧，大多实验与实践活动仅能完成一遍，要谈基本的活动经验以及实验操作细节，学生回忆时往往有一定的难度，《生物技术实践》（选修1）更以实践活动为主，而学生基本活动经验普遍缺乏。为帮助学生实验复习，以《生物技术实践》（选修1）中部分课题为例，现将基本的活动经验总结如下，供复习参考。
1 传统发酵技术的应用
1.1 实验材料、仪器的选择和处理
（1）葡萄冲洗的次数。葡萄用清水冲洗1～2遍即可。冲洗的主要目的是洗去浮尘，注意不要反复多次冲洗，以防止葡萄皮表面的酵母菌种的流失。另应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
（2）果酒发酵装置中排气管的选择。排气管为长而弯曲的胶管，在发酵过程中既能排出产生的C02 ，又能防止空气中杂菌的污染。
（3）腐乳制作中选用豆腐的含水量。选用豆腐的含水量为70%左右，用含水量过高的豆腐制作腐乳，不易成形。
（4）腐乳制作卤汤中酒含量的控制。酒的含量应控制在12%左右。酒精含量过高，腐乳成熟的时间将会延长；酒精含量过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败。
1.2 实验操作注意事项
（1）果酒发酵中，葡萄汁装入发酵瓶时要留1/3的空间。目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽02 后再进行酒精发酵；防止发酵过程中产生的C02 造成发酵液的溢出。
（2）果酒发酵时，每隔12h左右将瓶盖拧松一次或打开排气管，发酵后期拧松瓶盖或打开排气管的间隔时间可延长。发酵过程中会产生大量的C02 ，排气是防止瓶内压力升高引起爆炸，后期因产生C02 量的减少，瓶中气压变化不大。
（3）果醋发酵中 ，要适时通过充气口充气，以有利于醋酸菌的代谢。醋酸菌是好氧菌，将酒精变成醋酸时需要氧气的参与。
（4）腐乳制作中加盐腌制时用盐量。分层加盐，并随层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。
（5）装瓶时，操作要迅速小心。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封，以防止瓶口被污染。
1.3 实验结果分析与评价
（1）果酒发酵中有无杂菌污染。在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。
（2）一般情况下，葡萄酒呈红色的原因。在发酵过程中，随着酒精度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈红色。
（3）果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色，检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入物质的量浓度为3mol／L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色的变化。为使检验的结果更有说服力，还应设计对照实验。
（4）影响腐乳风味的因素。①菌种和杂菌：菌种是生产发酵的关键，如果菌种退化则表现出生化功能的变化，如水解速率、代谢产物等都会发生变化，从而影响品质。如有杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。②温度：温度影响菌丝的生长和代谢，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进入豆腐块的深层；温度高，菌丝易老化和死亡，影响品质。温度还影响生化反应速度。③发酵时间：发酵时间影响生化反应度及生化产物的量。④调味品：加入的各种酒类、糖类等辅料的多少也对口感有重要影响。
2 微生物的培养与应用
2.1 实验材料、仪器的选择和处理
(1)灭菌方法的选择。接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。
（2）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基时，称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速。目的是防止牛肉膏和蛋白胨吸收空气中水分。
（3）平板冷凝后，要将平板倒置。防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
（4）菌种保藏。对于频繁使用的菌种，采用临时保藏法，对此种保存的菌种3～6个月后需重新接种；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。将菌种放在低温环境中保藏的目的是降低微生物的新陈代谢速度，延缓菌种衰老。
2.2 实验操作注意事项
（1）利用平板划线法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意：①除第一次划线外，每次划线前要灼烧接种环；②冷却后从上一区划线末端开始划；③首尾区划线不相连。
（2）取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种。
（3）平板划线法最后灼烧接种环的目的。防止细菌污染环境和操作者自身。
2.3 实验结果分析与评价
（1）培养基的制作是否合格。如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（2）接种操作是否符合无菌要求。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
（3）是否进行了及时细致的观察与记录。培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。
3 酶的研究与应用
3.1 实验材料、仪器的选择和处理
（1）探讨含有蛋白酶洗衣粉的洗涤效果时，布料的选择。丝绸布料不合适，因为丝绸的主要成分是蛋白质，它会被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，损坏衣物。
（2）酶制剂应用的缺陷：①通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；②溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；③反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
（3）酵母细胞活化时容器的选择。向干酵母粉加蒸馏水，使酵母细胞由休眠状态重新恢复正常的生活状态。酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。
3.2 实验操作注意事项
（1）探讨加酶洗衣粉的最适温度时，不仅要用科学探究的方法研究日常生活中的问题，还需要将研究的结果应用到实际生活中去。这就需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温。通常情况下，冬季、春季、秋季、夏季可分别选取5℃、15℃、25℃和35℃的水温，因为这4个水温比较符合实际情况，对现实也有指导意义。
（2）探讨加酶洗衣粉的最适温度时，须严格控制无关变量。无关变量有：水量和水质、洗衣粉的用量、衣物质料与大小、浸泡与洗涤的时间、洗涤的方式等。
（3）固定化酶和固定化细胞方法的选择。一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。如果想把微生物的发酵过程变成连续的酶反应，则应该选择包埋法，因为固定化酶只固定了一种酶，而包埋法包埋细胞可涉及到一系列的酶；如果反应物是大分子物质，则应选择化学结合法或物理吸附法固定化酶，以便反应物与酶充分的接触。
(4)海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合时，溶化好的海藻酸钠溶液须冷却至室温后，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀。以免高温将酵母细胞烫死。
3.3 实验结果分析与评价
（1）判断洗衣粉洗涤效果的标准。可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积缩小等。
（2）检验凝胶珠质量是否合格的方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。
（3）观察表明凝胶珠的颜色和形状。如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，或者固定化酵母细胞时针筒离液面过近，高度不够，制作失败，需要再作尝试。
4 DNA的粗提取与鉴定
4.1 实验材料、仪器的选择和处理
（1）本实验选用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
（2）DNA的析出，实验一般要求采用预冷的95％的酒精溶液，但对比结果显示，常温下的酒精溶液也可产生明显效果。从理论上分析，预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
（3）实验过程中两次用到蒸馏水，目的不同。第一次目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
4.2 实验操作注意事项
（1）以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，以防止血液凝固。
（2）用洋葱作实验材料，加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。
（3）加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
（4）二苯胺试剂要现配现用。用二苯胺试剂鉴定DNA时，要注意三点：一是DNA丝状物要溶解于NaCl溶液中；二是要沸水浴加热；三是要增加对照实验。
4.3 实验结果分析与评价
（1）提取出了DNA。观察提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
（2）分析DNA中的杂质。本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
（3）同实验方法的比较。对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行比较研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
（本文发表于《实验教学与仪器》2013年第8期）